 |
ชุดการสังเคราะห์ CDNA สายแรก R1011/R1012 Reverse Transcriptase PCR รีเอเจนต์
รายละเอียดสินค้า:
| สถานที่กำเนิด: | จีน |
| ชื่อแบรนด์: | GDSBio |
| ได้รับการรับรอง: | / |
| หมายเลขรุ่น: | R1011/R1012 |
การชำระเงิน:
| จำนวนสั่งซื้อขั้นต่ำ: | 1 กล่อง |
|---|---|
| รายละเอียดการบรรจุ: | บรรจุภัณฑ์ขนาดเล็กหรือจำหน่ายจำนวนมากหรือ OEM |
| เวลาการส่งมอบ: | 8 วันทำงาน |
| เงื่อนไขการชำระเงิน: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
| สามารถในการผลิต: | 100 กล่อง/กล่อง ต่อวัน |
|
ข้อมูลรายละเอียด |
|||
| แมว. เลขที่: | R1011/R1012 | ความเข้มข้น: | R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns) |
|---|---|---|---|
| รูปร่าง: | ไม่มีสี | กลุ่ม: | ย้อนกลับ Transcriptase PCR รีเอเจนต์ |
| กิจกรรม: | ผ่าน | ความสามารถในการขยายสัญญาณ: | / |
| การพิมพ์โลโก้: | ด้วยการพิมพ์โลโก้ | แพ็คเกจการขนส่ง: | การบรรจุ |
| กำลังการผลิต: | 100 กล่อง/กล่อง ต่อวัน | สภาพการเก็บรักษา: | เก็บที่อุณหภูมิ -20°C |
| แสงสูง: | 20 rxns Reverse Transcriptase PCR รีเอเจนต์,100 rxns Reverse Transcriptase PCR รีเอเจนต์,20 rxns ชุดการสังเคราะห์ cdna สายแรก |
||
รายละเอียดสินค้า
RT - ชุด PCR
ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น
แมวหมายเลข R1011, 20 rxns
แมว No. R1012, 100 rxns
ส่วนประกอบของชุด
| ส่วนประกอบ | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/ไมโครลิตร) | 20 มล | 100 มล |
| RNasin (40U/ไมโครลิตร) | 12 มล | 60 มล |
| โอลิโก(dT)15(50μM) | 20 มล | 100 มล |
| ไพรเมอร์ hexamer แบบสุ่ม (50μM) | 20 มล | 100 มล |
| 5 × บัฟเฟอร์สายแรก | 80 มล | 400 มล |
| ddH ที่ปราศจาก RNase2อ | 1 มล | 1 มล. × 5 |
| dNTPs (แต่ละ 10mM) | 50 มล | 250 มล |
พื้นที่จัดเก็บ
ส่วนประกอบทั้งหมดของชุดควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°Cเก็บ RNA ควบคุมไว้ที่ -70°C เพื่อการจัดเก็บที่ยาวนานขึ้น
งคำอธิบาย
ชุด RT-PCR ได้รับการปรับแต่งเพื่อสังเคราะห์ cDNA สายแรกจากโพลี (A)+ หรือ RNA ทั้งหมดบริสุทธิ์ชุด RT-PCR สำหรับ RT-PCR ให้ผลผลิต cDNA ที่เพิ่มขึ้น ความไวสูง และการถอดเสียงแบบเต็มความยาวในรูปแบบที่สะดวกคุณได้รับส่วนประกอบทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ cDNA สายแรกที่ประสบความสำเร็จ ประหยัดเวลาและรับรองความสำเร็จในทุกการทดสอบชุด Reverse Transcriptase เป็นเวอร์ชันของ M-MLV RT ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมเพื่อลดกิจกรรมของ RNase H และเพิ่มความเสถียรทางความร้อนเอนไซม์นี้ใช้ในการสังเคราะห์ cDNA ที่ช่วงอุณหภูมิ 42-55°C ทำให้มีความจำเพาะเพิ่มขึ้น ให้ผลผลิตของ cDNA สูงขึ้น และผลิตภัณฑ์มีความยาวสมบูรณ์มากกว่าการถอดรหัสแบบย้อนกลับอื่นๆ
แอพพลิเคชั่น
การสังเคราะห์ cDNA สายแรกสำหรับ RT-PCR
การสร้างไลบรารี cDNA
ขั้นตอนเดียว RT-PCR
ส่วนขยายของไพรเมอร์
ฉันบันทึกสำคัญ
หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของไรโบนิวคลีเอส
ความบริสุทธิ์และความสมบูรณ์ของ RNA เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ cDNA แบบเต็มความยาวRNA สามารถย่อยสลายได้โดย RNase A ซึ่งเป็นสารปนเปื้อนที่มีความเสถียรสูงซึ่งพบได้ในสภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการใดๆส่วนประกอบทั้งหมดของชุดอุปกรณ์ได้รับการทดสอบอย่างเข้มงวดเพื่อให้แน่ใจว่าปราศจาก RNaseเพื่อป้องกันการปนเปื้อนทั้งสภาพแวดล้อมในห้องปฏิบัติการและตัวทำปฏิกิริยา สารละลายที่เตรียมไว้ทั้งหมดต้องปราศจาก RNasesคำแนะนำทั่วไปเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของ RNase:
- DEPC-ปฏิบัติกับหลอดและทิปปิเปตทั้งหมดเพื่อใช้ในการสังเคราะห์ cDNA หรือใช้ห้องปฏิบัติการที่ปราศจากนิวคลีเอสที่ผ่านการรับรอง
- สวมถุงมือเมื่อจัดการกับ RNA และรีเอเจนต์ทั้งหมด เนื่องจากผิวหนังเป็นแหล่งรวมของ RNasesเปลี่ยนถุงมือบ่อยๆ
- ใช้รีเอเจนต์ที่ปราศจาก RNase รวมถึงน้ำคุณภาพสูง (เช่น น้ำที่ผ่านการบำบัดด้วย DEPC)
- ใช้ตัวยับยั้ง RNase เช่น Dongsheng RNasin (#R2011) เพื่อป้องกัน RNA จากการทำงานของ RNases
- เก็บส่วนประกอบทั้งหมดของชุดอุปกรณ์ให้แน่นเมื่อไม่ใช้งานปิดท่อทั้งหมดให้แน่นระหว่างปฏิกิริยาการถอดความแบบย้อนกลับ
เทมเพลต RNA
การแยก RNA ของเซลล์ทั้งหมดด้วยวิธีมาตรฐานเหมาะสำหรับใช้กับชุดอุปกรณ์RNA บริสุทธิ์ต้องปราศจากเกลือ ไอออนโลหะ เอทานอล และฟีนอล เพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNAสารปนเปื้อนที่ติดตามสามารถกำจัดออกได้โดยการตกตะกอนของเอทานอลของ RNA ตามด้วยการล้างเม็ดสองครั้งด้วยเอทานอล 75% เย็นสำหรับการใช้งาน RT-PCR เทมเพลต RNA จะต้องไม่มีการปนเปื้อนของ DNAก่อนการสังเคราะห์ cDNA สามารถรักษา RNA ด้วย DNase I เพื่อกำจัดปริมาณ DNA ที่ติดตามได้ผู้ใช้ต้องได้รับ DNase Iทำปฏิกิริยาควบคุม (RT-ลบ) เสมอ ซึ่งรวมถึงส่วนประกอบทั้งหมดสำหรับ RT-PCR ยกเว้นสำหรับเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเทส
RNase H การย่อยอาหาร
ความไวของขั้นตอน PCR สามารถเพิ่มได้ (โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเทมเพลตแบบยาว) โดยการนำเทมเพลต RNA ออกจากโมเลกุลลูกผสม cDNA:RNA โดยการย่อยด้วย RNAse H หลังจากการสังเคราะห์สายแรกการมีอยู่ของ RNAse H ในระหว่างการสังเคราะห์สายแรกจะทำให้แม่แบบ mRNA ลดลง ส่งผลให้การสังเคราะห์ cDNA แบบเต็มความยาวลดลงและผลผลิตของ cDNA สายแรกลดลง
ไพรเมอร์
การสังเคราะห์ cDNA สายแรกสามารถไพรเมอร์ด้วยไพรเมอร์ oligo(dT)15 ไพรเมอร์แบบสุ่มหรือไพรเมอร์เฉพาะยีน
การสังเคราะห์ cDNA ของ Oligo(dT)15 ไพรม์จากหางของโพลี(A) ที่ปลาย 3' ของ mRNA ของยูคาริโอตRandom Primers เริ่มต้นการสังเคราะห์ cDNA จากประชากร RNA ทั้งหมด (rRNA และ mRNA)ดังนั้น การใช้ไพรเมอร์แบบสุ่มสำหรับการสังเคราะห์สายแรกส่งผลให้ cDNA ที่สร้างขึ้นมีความซับซ้อนมากขึ้นเมื่อเทียบกับไพรเมอร์ oligo(dT)15เป็นผลให้ความไวและความจำเพาะของปฏิกิริยา PCR ที่ตามมาอาจลดลงอย่างไรก็ตาม มีการใช้งานหลายอย่างที่เป็นประโยชน์ในการใช้ไพรเมอร์แบบสุ่ม เช่น การสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ mRNA โดยไม่มีหางของโพลี(A) หรือการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ตัวอย่าง RNA ที่อุดมด้วยโพลี(A)
ไพรเมอร์เฉพาะยีนใช้เพื่อสังเคราะห์ cDNA เฉพาะจากพูลของ RNA หรือ mRNA ทั้งหมดและผู้ใช้ต้องได้รับ
อันดับแรก- สขั้นตอนการสังเคราะห์ trand cDNA
ปฏิกิริยา cDNA สายแรกสามารถดำเนินการเป็นปฏิกิริยาเดี่ยวหรือเป็นชุดของปฏิกิริยาคู่ขนานกับแม่แบบ RNA ที่แตกต่างกันดังนั้น ส่วนผสมของปฏิกิริยาสามารถเตรียมได้โดยการรวมรีเอเจนต์ทีละตัว หรือสามารถเตรียมส่วนผสมหลักที่มีส่วนประกอบทั้งหมดยกเว้นเทมเพลต RNAขึ้นอยู่กับโครงสร้างของเทมเพลต RNA ขั้นตอนแยกต่างหากสำหรับการทำให้เสียสภาพของ RNA และการหลอมไพรเมอร์อาจปรับปรุงผลลัพธ์ของ RT-PCR
พีโรโตคอล
ฉัน.การสังเคราะห์ cDNA สายแรก
1. เติมรีเอเจนต์ต่อไปนี้ลงในหลอดที่ปลอดเชื้อและปราศจากนิวคลีเอสบนน้ำแข็งตามลำดับที่ระบุ:
| เทมเพลต RNA |
พอลิ(A) mRNA หรือ RNA เฉพาะ |
1-5 มก |
| ไพรเมอร์ |
โอลิโก (dT)15ไพรเมอร์ หรือไพรเมอร์สุ่ม hexamer |
1 ไมโครลิตร 1 ไมโครลิตร |
| น้ำที่ผ่านการบำบัดด้วย DEPC | ถึง 12.4 ไมโครลิตร | |
| ปริมาณรวม | 12.4 ไมโครลิตร | |
2. ผสมเบา ๆ หมุนเหวี่ยงสั้น ๆ และบ่มที่อุณหภูมิ 70°C เป็นเวลา 5 นาทีแช่เย็นบนน้ำแข็ง หมุนและวางขวดกลับบนน้ำแข็ง
3. เตรียมส่วนผสมการสังเคราะห์ cDNA ต่อไปนี้ เพิ่มส่วนประกอบต่อไปนี้ตามลำดับที่ระบุ:
| 5x บัฟเฟอร์สายแรก | 4 ไมโครลิตร |
| dNTPs (แต่ละ 10 mM) | 1 ไมโครลิตร |
| ร.นาสิน | 0.6 ไมโครลิตร |
| M-MLV | 1 ไมโครลิตร |
4. ผสมเบา ๆ แล้วหมุนเหวี่ยงสั้น ๆ
5. สำหรับโอลิโก (dT)15บ่มเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิ 42°Cสำหรับการสังเคราะห์ hexamer primed แบบสุ่ม ให้บ่มเป็นเวลา 60 นาทีที่ 37°C
6. ยุติปฏิกิริยาด้วยการให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 70°C เป็นเวลา 5 นาที
ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาการถอดรหัสย้อนกลับสามารถใช้ได้ทันทีในปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNA สายที่สอง หรือเก็บไว้ที่ -20°C เป็นเวลาน้อยกว่าหนึ่งสัปดาห์เพื่อการเก็บรักษาที่ยาวนานขึ้น แนะนำให้ใช้ -70°C
ครั้งที่สองการขยาย PCR ของ cDNA สายแรก
ผลิตภัณฑ์ของการสังเคราะห์ cDNA สายแรกสามารถใช้ได้โดยตรงใน PCR หรือ qPCRปริมาตรของของผสมปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNA สายแรกไม่ควรมีมากกว่า 1/10 ของปริมาตรปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดโดยปกติแล้ว 2 ไมโครลิตรของส่วนผสมของปฏิกิริยาการสังเคราะห์ cDNA สายแรกจะถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ที่ตามมาในปริมาตรรวม 50 ไมโครลิตร
Dongsheng Biotech นำเสนอชุดผลิตภัณฑ์ต่างๆ เพื่อช่วยให้คุณประสบความสำเร็จใน PCRสำหรับเอนไซม์ Taq Polymerase, HS Taq DNA Polymerase, FS Taq DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase และ Fusion Pfu DNA Polymerase ให้ประสิทธิภาพ PCR ที่มีความไวสูง มีประสิทธิภาพ และมีความเที่ยงตรงสูงนอกจากนี้เรายังมี Long Taq DNA Polymerase เพื่อประสิทธิภาพ PCR ที่ยาวนาน
